摘要：近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院/北京石墨烯研究院彭海琳課題組、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉課題組和北京大學(xué)工學(xué)院韋小丁課題組合作在《自然-方法學(xué)》Nature Methods發(fā)表了題為“Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM”的研究論文，報(bào)道了新型超平整石墨烯電鏡載網(wǎng)，破解了高分辨冷凍電鏡表征中均勻薄冰的制備難題。該工作表明，超平整石墨烯/均勻薄冰支撐膜能顯著提升冷凍電鏡成像質(zhì)量和效率，實(shí)現(xiàn)多種小蛋白（分子量小于70 kDa）的高分辨三維重構(gòu)。

圖1 懸空石墨烯冷凍電鏡支撐膜的平整度影響冰層厚度均一性和成像質(zhì)量

單顆粒冷凍電鏡是目前揭示生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的重要手段之一。在冷凍電鏡成像過(guò)程中，生物大分子被封裝在薄層玻璃態(tài)冰中，在電子束輻照下，仍處于原始結(jié)構(gòu)和本征狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明，均勻薄冰層的制備是實(shí)現(xiàn)高分辨冷凍電鏡成像的關(guān)鍵因素之一，尤其是對(duì)于分子量較小的蛋白（小于100 kDa），因?yàn)楸鶎舆^(guò)厚會(huì)嚴(yán)重影響信噪比，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高分辨率結(jié)構(gòu)重構(gòu)。然而，樣品制備過(guò)程中，冰層厚度和均一性目前仍難以精確控制，已成為高分辨冷凍成像的主要挑戰(zhàn)之一。

針對(duì)該關(guān)鍵問(wèn)題，北京大學(xué)彭海琳課題組、清華大學(xué)王宏偉課題組及北京大學(xué)韋小丁課題組合作，揭示了冷凍電鏡樣品支撐膜的表面粗糙度和冰層均一性的關(guān)系，并開(kāi)發(fā)了超平整石墨烯電鏡載網(wǎng)，解決了均勻薄冰的制備難題。研究表明，超平整石墨烯支撐膜能形成更薄更均勻的玻璃態(tài)冰，背景襯度低，有利于高信噪比和高分辨率的冷凍電鏡成像?；诔秸?均勻薄冰支撐膜，他們對(duì)三種分子量較小的鏈霉親和素蛋白（streptavidin，52 kDa）、血紅蛋白（hemoglobin，64 kDa）和甲胎蛋白（α-fetoprotein，67 kDa）進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，分別得到了2.2 ?、3.5 ?和2.6 ?的高分辨率重構(gòu)。進(jìn)一步的，他們還證明該超平整石墨烯載網(wǎng)在冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

圖2  超平整石墨烯載網(wǎng)的設(shè)計(jì)、制備與力學(xué)性質(zhì)表征

彭海琳課題組與劉忠范課題組前期合作開(kāi)發(fā)了銅(111)/藍(lán)寶石晶圓上超平整石墨烯單晶的外延生長(zhǎng)方法和批量制備技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，彭海琳課題組基于超平整石墨烯單晶晶圓和“面對(duì)面”超潔凈無(wú)膠轉(zhuǎn)移方法，成功實(shí)現(xiàn)了超平整懸空石墨烯電鏡載網(wǎng)的批量化制備，單層石墨烯懸空膜完整度高達(dá)98%，平均表面粗糙度低至0.7 nm。原子力顯微鏡（AFM）納米壓痕技術(shù)的力學(xué)表征結(jié)果表明，超平整石墨烯支撐膜具有接近于石墨烯理論值的楊氏模量和斷裂強(qiáng)度，遠(yuǎn)高于粗糙起伏有褶皺的石墨烯。進(jìn)一步分析表明，超平整石墨烯支撐膜具有約0.2 N/m的預(yù)應(yīng)力，而預(yù)應(yīng)力是制備均勻薄冰的關(guān)鍵因素。冷凍制樣過(guò)程中，在滴加樣品溶液后，需要用濾紙吸走支撐膜上的多余液體以制備薄層液膜。該過(guò)程會(huì)產(chǎn)生很大的剪切力（kPa量級(jí)），導(dǎo)致樣品液膜產(chǎn)生起伏，進(jìn)而造成冰層的起伏。超平整石墨烯中預(yù)應(yīng)力的存在使其能抵消剪切力產(chǎn)生的影響，即使在100 kPa的剪切力下依然保持平整。

圖3 超平整石墨烯顯著提高冷凍電鏡成像質(zhì)量，成功解析streptavidin（52 kDa）的高分辨三維重構(gòu)

他們將超平整石墨烯載網(wǎng)用于冷凍電鏡成像中，發(fā)現(xiàn)形成的均勻薄冰能顯著提高成像質(zhì)量。一方面，預(yù)應(yīng)力使得冰層在電子束輻照下不易發(fā)生翹曲，有效抑制了樣品在表征時(shí)的漂移。另一方面，在不同的傾轉(zhuǎn)角度下（-60°~60°），石墨烯表面均無(wú)褶皺結(jié)構(gòu)，避免了高角度成像時(shí)褶皺對(duì)樣品信號(hào)的遮蔽。經(jīng)過(guò)測(cè)量，超平整石墨烯支撐膜所制備的冰層厚度約為20 nm，且厚度比較均勻，既可有效封裝生物大分子顆粒，也不會(huì)過(guò)多引入額外的背景噪音。大多數(shù)生物大分子顆粒吸附于石墨烯表面，幾乎處于同一高度，降低了成像時(shí)同一視野下局部欠焦值的差異。與粗糙起伏的石墨烯對(duì)比，超平整石墨烯保證了高質(zhì)量數(shù)據(jù)的收集，提升了成像效率。綜合以上優(yōu)勢(shì)，作者利用新型超平整石墨烯載網(wǎng)對(duì)三種小蛋白streptavidin（鏈霉親和素蛋白，52 kDa）、hemoglobin（血紅蛋白，64 kDa）和α-fetoprotein（甲胎蛋白，67 kDa）進(jìn)行冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，分別得到了2.2 ?、3.5 ?和2.6 ?的高分辨率結(jié)構(gòu)重構(gòu)。

該研究工作以“超平整石墨烯/均勻薄冰支撐膜用于高分辨冷凍電鏡成像”（Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM）為題，于2022年12月15日發(fā)表在《自然-方法學(xué)》（Nature Methods）。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院彭海琳教授、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉教授、劉楠博士以及北京大學(xué)工學(xué)院韋小丁教授為論文共同通訊作者，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士畢業(yè)生鄭黎明、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉楠博士、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生高嘯寅以及北京大學(xué)工學(xué)院博士畢業(yè)生朱文清為論文共同第一作者。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、中國(guó)博士后科學(xué)基金、騰訊基金會(huì)等資助，并得到了北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院的分子材料與納米加工實(shí)驗(yàn)室（MMNL）儀器平臺(tái)的支持。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41592-022-01693-y